Mediante una muestra de hisopo orofaríngeo de un paciente con coronavirus 2019 (COVID-19) que había regresado a Nepal después de un viaje en Wuhan, China, se obtuvo una secuencia del genoma completo de una cepa aislada del síndrome respiratorio agudo 2 (SARS-CoV-2).

El 12 de marzo de 2020 se publicó el artículo científico “Secuencia del genoma completo de un nuevo coronavirus 2019 (SARS-COV2-2) en una cepa aislada en Nepal” en la revista Microbiology Resource Announcements para brindar un recuento sobre el proceso. Cabe destacar que en este artículo participó la doctora Lysien Zambrano, por parte de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras (UNAH).

Es de resaltar que la obtención de genomas es de importancia para el diagnóstico, la elaboración de pruebas que sirven para identificar el virus, para el estudio de posibles blancos de tratamiento y también vacunas.

“El síndrome respiratorio agudo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), de la familia Coronaviridae Genus Betacoronavirus, se está ampliando en China, causando la enfermedad de coronavirus 2019 (COVID-19), y está afectando a otros países asiáticos y no asiáticos. Casos importados han sido reportados en países como Japón, Singapur, Hong Kong, Tailandia, Nepal, entre otros. Reportamos aquí la secuencia de genoma completo de un paciente de Nepal de SARS-CoV-2; la infección fue adquirida en China e importada a Nepal”, se expuso en el artículo.

El paciente era un hombre originario de 32 años, estudiante en la Universidad Tecnológica de Wuhan, China; no tenía historial de comorbilidades y regresó a Nepal con tos, fiebre leve y congestión de garganta; mostrando síntomas de COVID-19.

Dadas estas señales se recolectó la muestra de hisopo orofaríngeo en el Centro Nacional de Influenza, el Laboratorio Nacional Público de Salud en Kathmandu, Nepal. Luego fue sometido al laboratorio WHO en la Universidad de Hong Kong, específicamente en la región administrativa especial de Hong Kong, donde la muestra de (BetaCoV/Nepal/61/2020) fue confirmada y secuenciada. La muestra dio positivo por SARS-CoV-2 utilizando una transcriptasa inversa en tiempo real (rRTt-PCR).

Proceso

La secuenciación se realizó mediante un sistema Illumina MiSeq, con un algoritmo de alineación Burrows-Wheeler MEM y un método de montaje 0.7.5a-r405. El genoma completo fue amplificado directamente del ARN (un ácido nucleico que se encarga de trasladar la información genética del ADN) de la muestra original con cebadores específicos del gen para un marco abierto de lectura 1b (ORF1B) y N para cubrir el genoma completo.

Según genoma.gov se llama marco abierto de lectura o marco de lectura (siglas ORF del inglés "Open reading frame") abierta a la secuencia de ARN comprendida entre un codón de inicio de la traducción y un codón de terminación. Un codón es una secuencia de tres nucleótidos de ADN o ARN que corresponde a un aminoácido específico.

El genoma fue obtenido con lecturas de mapeo usando BWA-MEM 0.7.5a-r405 para referenciar el genoma SARS-CoV-2. “Los tamaños esperados de ampliación de ORF1b y pruebas de gene N son 132 bp and 110 bp, respectivamente. Las lecturas crudas fueron primero limpiadas recortando las bases de baja calidad con Trimmomatic 0.36 (-phred33, LEADING:20, TRAILING:20, SLIDCitationINGWINDOW:4:20, MINLEN:40)”.

Con el montaje producido por MEGAHIT 1-2-9 (de novo assembly) se validó de forma cruzada, y la secuencia de referencia fue usada de la Iniciativa Global de Compartición de las bases de datos sobre la influenza (GISAID). Para evaluar la calidad de la secuencia antes y después de los recortes se usó un Fast QC 0.11.8. Hubo 5,246,584 secuencias emparejadas en los datos crudos. Un total de 9,891,431 registros fueron incluidos en el alineamiento basado en referencia después de los recortes y 9,887,093 (99.96%) de ellos fueron mapeados al genoma de referencia de SARS-CoV-2.

“Generamos una secuencia de consenso de 29,811 bp sin brecha y con un alto índice de cobertura. Sitios de unión en las terminaciones 5= y 3= fueron removidos, resultando en este genoma siendo de 59 nucleótidos (nt) más pequeños que un genoma de referencia en GenBank (accession number NC_045512), excluyendo el genoma de cola de (A) poli. Para análisis filogenéticos, secuencias del genoma completo SARS-CoV-2 fueron alineados con CLUSTAL W, usando un MEGA 10.0.5. La secuencia nueva de SARS-CoV-2 fue comparado con genomas existentes usando NCBI BLAST en línea”, se expuso en el artículo.

Las coordinadas 1 al 29811 de la secuencia del BetaCoV/Nepal/61/2020 fueron idénticas a la secuencia 2019-nCoV WHU01 aislado y del 15 al 29825 menos en el sitio 24019, con una T en vez de la C en 2019-nCoV WHU01. Algunas mutaciones que fueron identificadas fueron T8782C (en ORF1a, codons AGT a AGC, mutación silenciosa), T9561C (in ORF1a, codones TTA a TCA, mutación no silenciosa), C15607T (en ORF1b, codones CTA a  TTA, mutación silenciosa), C28144T (en ORF8b, codones TCA a TTA, mutación no silenciosa), y T29095C (en nucleocápside, codones TTT a TTC, mutación silenciosa).

Opinión de investigadores

Como autores del artículo se encuentran Ranjit Sah, Alfonso J. Rodriguez-Morales, Runa Jha, Daniel K. W. Chu, Haogao Gu, Malik Peiris, Anup Bastola, Bibek Kumar Lal, Hemant Chanda Ojha, Ali A. Rabaan, Lysien I. Zambrano, Anthony Costello, Kouichi Morita, Basu Dev Pandey, Leo L. M. Poond.

“De Honduras aún no se ha obtenido el genoma completo del SARS-CoV-2, es algo pendiente por hacer. Hemos colaborado con investigadores de otros países, para apoyar su secuenciación y divulgación, como el caso de Nepal. Los genomas se secuencian con equipos que son capaces de identificar las bases de ADN o ARN que tiene una muestra obtenida de un caso identificado inicialmente por la reacción en cadena de polimerasa, donde se ha hecho el aislamiento de su material genético”, manifestaron Lysien Zambrano por parte de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras, y Alfonso Rodríguez de la Universidad Tecnológica de Pereira (UTP) de Colombia, líder del grupo de la publicación.

Si quiere leer la publicación, haga clic en el siguiente link: https://www.researchgate.net/publication/339883636_Complete_Genome_Sequence_of_a_2019_Novel_Coronavirus_SARS-CoV-2_Strain_Isolated_in_Nepal